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【获奖论文】骨与软组织肉瘤PDX模型的建立及应用研究

发布时间:2017-11-09


文章来源:中华骨科杂志, 2017,37(06) : 340-346

作者:孙梦熊 尹飞 孙伟 沈嘉康 马小军 傅泽泽 周承豪 王卓莹 华莹奇 蔡郑东

摘要  

目的

建立恶性骨与软组织肉瘤患者来源移植瘤模型(patient-derived xenograft,PDX)模型并统计其建模的成功率,观察PDX化疗反应与临床的符合率,以为筛选敏感二、三线药物提供理论基础。

方法

收集自2015年1月至2016年5月共31例骨与软组织肿瘤患者,男12例,女19例;年龄为9~67岁,平均(28.5±19.9)岁。手术当天取材,取患者手术中新鲜的活性组织,无菌条件下转移到实验室后,切至约2 mm3大小,接种于采用穿刺套管针接种于T淋巴细胞缺陷小鼠(BAL B/C裸鼠)或T、B淋巴细胞双缺小鼠(SCID小鼠)背部皮下,待小鼠背部肿瘤长至1~2 cm直径时取出肿瘤组织并传代,同时保存P0组织;若小鼠背部肿瘤3个月无生长则视为建模失败;分别接种化疗前和化疗后的病例,比较化疗对PDX建模成功率的影响,同时观察不同病理类型病例的建模成功率,观察PDX建模成功率与患者预后的关系;药物试验:将成瘤的PDX小鼠分组,每组3只,不同组给予不同的化疗药物,分别按照化疗药物特性给药,通过T/C计算抑制率,比较得出PDX模型敏感药物及不敏感药物,并与对应的患者用药情况进行比较。

结果

本组共接种骨与软组织肉瘤31例,总体建模成功率45.2%。按病理亚型分别为:骨肉瘤24例,建模成功率37%;平滑肌肉瘤2例,成功率100%;软骨肉瘤2例,成功率50%;尤文肉瘤1例成功;纤维肉瘤1例及滑膜肉瘤1例均未成功。化疗后建模成功率33%(4/12),未化疗建模成功率53%(10/19)。PDX建模较容易的患者往往提示预后不佳,PDX模型对化疗的敏感性与临床实际疗效具有较好的相符合性。

结论

骨与软组织肉瘤的PDX成功率在30%~40%,与肿瘤病理类型、化疗有关,PDX与临床病例具有较好的相似性,有望用于患者个体化药物筛选。

骨与软组织肉瘤是一类起源于间叶组织的恶性肿瘤,有多种不同的病理亚型,如骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤等[1]。从基因的角度,骨与软组织肉瘤可以大体分为两类:一种是基因组学复杂型,即肿瘤细胞中有大量的染色体突变或核型改变;另一种基因组学相对简单,往往表现为染色体某一位点突变或染色体转位[2]。尽管骨与软组织肉瘤只占所有新发肿瘤的1%,然而其好发于儿童和青少年,并且会导致19%~21%与肿瘤相关的死亡,同时病理多样性及基因组异质性使得这类肿瘤往往难以诊断[3]。另外,在某一种类型肉瘤上的研究成果不能完全转化到另一种类型[1]。因此,在该类肿瘤的诊疗方面,仍需要进行大量有效的研究。骨与软组织肉瘤目前治疗方法除手术外,为了预防复发和转移会辅助以化疗,目前临床应用的化疗一线药物主要有甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂等,方案较少。近期研究发现在化疗反应不佳的骨肉瘤患者中,辅助以异环磷酰胺和依托泊苷的化疗方案增加了化疗反应的毒性,且并未延长患者的生存期[4]。因此,需要进一步研究行之有效的化疗方案。

目前精准医疗已成为医学特别是肿瘤学科的热点,各类关于肿瘤的精准医疗的研究正如火如荼地开展中。精准医疗是根据患者的某一基因突变进行针对性的靶向治疗,其中不乏有一些成功的案例[5]。然而,很多患者并没有从精准医疗中获益,美国MD安德森肿瘤中心筛选了2 600例测序,其结果显示只有6.4%的患者适用某种特定基因突变的靶向药物[6]。造成了一种即使测定到了突变并不等于靶向药物就一定有效的尴尬局面。而患者来源移植瘤模型(patient-derived xenograft,PDX)是将患者的肿瘤组织接种在免疫缺陷的老鼠体内(一般为皮下),让其在小鼠体内成瘤。该模型既保留了患者肿瘤本身分子表型和基因型,保存了肿瘤异质性,同时可以利用动物模型对肿瘤的发病机理及治疗进行研究,进一步对患者自身的诊疗提供依据。目前,骨与软组织肉瘤研究领域内国内未见有类似PDX模型报道。

本研究拟通过建立模型、比较药物疗效及与临床病例之间的相关性等方法,以建立恶性骨与软组织肉瘤PDX模型,目的在于:①统计骨与软组织肉瘤PDX建模的成功率,观察并分析病理类型及化疗对PDX建模的影响以及PDX建模的成功与否与患者的预后之间的关系;②观察PDX化疗反应与临床的符合率。

资料与方法

一、纳入与排除标准

纳入标准:①临床病理诊断为骨与软组织肉瘤;②可获取活性肿瘤组织者;③同意进行PDX建模并签署知情同意书者。

排除标准:①无法病理明确诊断的骨与软组织肉瘤者;②血液系统肿瘤、肾癌、乳腺癌等骨与软组织转移瘤患者(即非原发骨肿瘤者);③患者身体条件不允许进行手术或穿刺活检者。

二、一般资料

依上述纳入及排除标准,收集自2015年1月至2016年5月共31例于我院行手术治疗的骨与软组织肿瘤患者的资料,其中男12例,女19例;年龄为9~67岁,平均为(28.5±19.9)岁。

按照病理类型分为:骨肉瘤24例(77.4%,24/31),平滑肌肉瘤2例(6.5%,2/31),软骨肉瘤2例(6.5%,2/31),尤文肉瘤1例(3.2%,1/31),纤维肉瘤1例(3.2%,1/31),滑膜肉瘤1例(3.2%,1/31)。

按化疗与否分:化疗后病例12例(38.7%,12/31),未化疗病例19例(61.3%,19/31)。

按照肿瘤部位分为:骨盆7例(22.6%,7/31),股骨14例(45.2%,14/31),胫骨2例(6.5%,2/31),腓骨1例(3.2%,1/31),肱骨5例(16.1%,5/31),头皮1例(3.2%,1/31),肺1例(3.2%,1/31)。

本研究获上海交通大学附属第一人民医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

三、建立PDX动物模型

对象为临床病理确诊为骨与软组织肉瘤的患者,于患者手术当日进行取材。术中切取活性最高的肿瘤组织(通常为肿瘤包膜下无任何坏死区域)。

将取得的活性肿瘤组织切成大小约2~4 mm3的10块,并于无菌条件下4 h内使用穿刺套管针接种于BAL B/C裸鼠或SCID小鼠(上海必凯实验动物中心提供)的背部皮下。接种后每周观察小鼠肿瘤生长情况,待肿瘤直径长至1~2 cm时,断颈处死荷瘤小鼠,无菌条件下切取体内肿瘤为2~4 mm3的小块,分别接种新的小鼠皮下进行传代,并保存P0组织。

若3个月未见肿瘤生长,则视为建模失败,本研究中的PDX模型由中美冠科生物技术(太仓)有限公司建立。

分别按照肿瘤病理类型和是否化疗对接种后肿瘤的成瘤率进行统计,并对已成瘤组织切除后行包埋固定,行HE染色,与患者标本的进行对比。

四、PDX动物模型化疗药物实验

将建模成功的PDX动物模型,传代稳定后接种一定数量的小鼠(按照需要测试的药物种类数量n,接种3n+3只小鼠)。待动物模型的肿瘤大小生长至约100 mm3时,筛选肿瘤大小接近的模型,并分组为对照组和各化疗药物实验组,每组3只小鼠。

根据化疗药物的临床使用指南中的方案,并按化疗药物小鼠/人剂量换算分别定期给予每组小鼠化疗药物,定期测量小鼠肿瘤最长径和最短径,计算小鼠肿瘤体积:V=最长径×最短径2/2[7]。比较各组肿瘤生长情况,并通过治疗组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量(T/C)计算抑制率,得出敏感药物和非敏感药物。

五、统计学方法

采用SPSS 22.0(IBM公司,美国)统计软件包进行统计学分析,计数资料采用(±s)表示,采用Stundent t检验比较PDX模型接种后各组药物处理组与对照组之间的差异,检验水准α值取双侧0.05

结果

一、建立PDX模型成功率

本研究中共接种31例PDX模型,其中成功建立动物模型14例,成功率为45.2%(表1)。

各病理类型肿瘤建模的成功率分别为:骨肉瘤9例(37.4%,9/24),平滑肌肉瘤2例(100%,2/2),软骨肉瘤1例(50%,1/2),尤文肉瘤1例(100%,1/1),纤维肉瘤(0/1)及滑膜肉瘤(0/1)均无建模成功者。

二、PDX模型成功率与化疗之间的关系

未化疗PDX建模成功率为53%(10/19),化疗后为33%(4/12),较未化疗低近20%。

三、PDX建模成功与否与患者的预后的关系

建模成功14例中已死亡9例(64.2%,9/14)。能够建立PDX模型的患者往往预后不佳,特别是PDX模型建立速度越快者,死亡速度也越快(表1)。如最短成功建模者(41 d),诊断至死亡时间只有26个月;相反,成功建模时间>100 d者,生存时间均较长。因此,PDX建模成功的患者往往预后不佳,并且建模速度越快,预后越差。

四、PDX模型接种后药物处理的作用

(一)原发骨肉瘤患者PDX模型

本组1例,男,12岁,因右侧膝关节疼痛就诊,影像学检查提示右股骨下段肿瘤,穿刺病理示骨肉瘤。术前予阿霉素+顺铂,甲氨蝶呤方案化疗4次,行肿瘤切除+肿瘤假体置换,术后病理为右股骨骨肉瘤。术后给予阿霉素+顺铂,异环磷酰胺方案化疗6周期。

肿瘤切除同时行PDX建模并成功建立PDX动物模型。其中P1~P2肿瘤动物模型的生长曲线表示,PDX模型在P2代时已稳定生长。PDX模型切片HE染色与术后患者肿瘤HE染色的形态学基本保持一致。在行术后化疗的同时,使用同样的化疗药物给PDX模型动物模型行检测,发现多西紫杉醇在PDX模型中表现出较好的抑瘤作用,而顺铂在给药后肿瘤继续增大,表现出耐药性,这与我们临床治疗中患者之后出现的顺铂耐药结果一致(图1)。


图1 原发骨肉瘤PDX模型建立及药物实验 A,B,C,D 患者PDX模型的建模示意,可见PDX模型在小鼠皮下长出 E,F 患者的病理切片(E)与PDX动物模型病理切片(F)HE染色的对比,细胞形态结构基本相同,HE染色×100 G 建模后PDX模型P1~P2代肿瘤生长情况稳定 H 利用顺铂和多西紫杉醇単药处理PDX模型后PDX肿瘤的生长情况,顺铂处理后肿瘤继续长大,多西紫杉醇处理后肿瘤缩小

(二)转移性骨肉瘤PDX模型

本组1例,女,11岁,2013年2月因右侧股骨远端肿瘤行保肢手术,术后化疗方案为阿霉素+顺铂,甲氨蝶呤。术后19个月发现头顶部约3 cm×4 cm大小肿块,无红肿,无压痛,皮温正常,穿刺病理证实为骨肉瘤头皮转移。行吉西他滨+多西紫杉醇化疗6次后复查发现头皮下肿瘤几乎消失,5个月复查发现头皮下肿瘤复发,行肿瘤切除,PDX建模,并继续行异环磷酰胺+依托泊苷方案化疗6次。

化疗期间PDX成功建模,PDX组织学特性与临床切除标本组织学特性相一致,进一步行药物敏感性筛选,发现阿帕替尼、安罗替尼、索拉菲尼和多西他赛对PDX模型敏感,但患者未按照建议服药,致头皮肿瘤进展死亡(图2)。


图2 转移性骨肉瘤PDX模型建立及药物实验 A 建模后PDX模型的P0~P1代肿瘤生长情况,到P1代时已生长稳定 B,C 患者病理切片与PDX动物模型病理切片HE染色的对比,细胞形态结构基本相同,HE染色×100 D 各种不同药物处理后PDX模型的T/C,其中阿帕替尼、安罗替尼、索拉菲尼和多西他赛对PDX模型敏感,明显抑制了肿瘤的生长

(三)尤文肉瘤PDX模型

本组1例,男,9岁,因左髂骨肿瘤入院,穿刺病理示左髂骨尤文肉瘤,行长春新碱+放线菌素D+环磷酰胺,异环磷酰胺+依托泊苷化疗14次,后行手术切除肿瘤。接种PDX模型并成功建模,PDX组织学特性与临床切除标本相一致,术后四个月肿瘤局部复发,PDX模型行药物敏感实验筛选结果提示顺铂和多西紫杉醇化疗敏感,但患者未按照建议给药,致肿瘤进展死亡(图3,表2)。

图3 尤文肉瘤PDX模型建立及药物实验 A,B,C 患者PDX模型的建模示意图,可见尤文肉瘤PDX模型在小鼠体内建立成功 D,E 患者的病理切片与PDX动物模型病理切片HE染色的对比,PDX模型与患者HE染色细胞形态结构基本相同,HE染色×100

讨论

一、PDX建模的成功率,病理类型及化疗对PDX建模的影响

本研究中,将骨与软组织肉瘤患者肿瘤接种于裸鼠皮下,总体成瘤率45.2%,其中骨肉瘤37.5%,并发现骨与软组织肉瘤PDX模型接种的成功率与病理类型存在一定的相关性。在其他类型肿瘤中,将肺癌患者的肿瘤组织接种到免疫缺陷的裸鼠皮下,成瘤率24.5%[8]。在高级别肉瘤中,Stebbing等[9]将29例肿瘤接种于裸鼠,22例成瘤,成瘤率76%。另有报道显示在一组胃癌病例中接种成功率为34.1%(63/185)[10]。成功的建模为进一步个体化治疗提供了基础,也为生物靶点的研究提供了支持,我们建立的PDX模型也将为患者的药物筛选及进一步的科研提供有效的工具和前提。


化疗后骨与软组织肉瘤PDX模型接种成功率明显低于未化疗时肿瘤接种成功率,某种程度上说明了临床中所进行的化疗对患者的肿瘤具有杀伤作用或有抑制肿瘤活性的作用,同时化疗药物对肿瘤细胞本身的代谢会产生一定的影响,在一些敏感的肿瘤细胞中可以达到杀死肿瘤细胞的效果。从一个侧面也解释了之前患者化疗药物的有效性。同时,由于化疗也会带来骨与软组织肉瘤患者的异质性,因此在化疗后患者出现复发时更加有必要进行PDX建模并重新筛选有效药物,争取以最短时间筛选出最有效的化疗药物。

二、PDX建模的成功率与预后的关系

PDX建模的快慢提示着患者的预后的好坏,容易成瘤的PDX模型往往显示出高度的恶性或侵袭性。这种预后差的患者建模速度加快及建模易成药,肿瘤发展致死亡。能够建立PDX模型的患者,肿瘤的恶性程度较高,PDX建立速度越快,恶性程度越高。因此,有时候甚至在药物刚刚筛选出,患者未必来得及按时服药而死亡,抑或肿瘤的高度异质性使得肿瘤细胞发生了新的突变,影响了药物的疗效。尽管如此,PDX模型对临床指导用药特别是靶向药物具有很实际的意义。

以往骨与软组织肉瘤动物模型往往以细胞系建立为主,而细胞系的相对单一性,不能更好的代表临床中多种多样的肿瘤类型。以患者肿瘤为基础建立的动物模型可更好的代表肿瘤的生物学行为,为临床新药的研发提供良好的实验基础,在肿瘤异质性、耐药及转移等方面可以提供良好的实验模型,可以用来作为肿瘤耐药标志物的筛选。

综上所述,PDX模型作为骨与软组织肉瘤的动物模型有以下优点:①PDX模型可模拟原肿瘤病灶的生物学特性;②为患者提供药敏信息及肿瘤的基因信息;③可提供充足的组织标本来源进行其他研究;④可进一步分离细胞系进行研究。然而,骨与软组织肉瘤PDX模型仍有不足之处:①建立模型往往耗费时间较长,费用较大,成功率受肿瘤的组织学类型及化疗影响较大;②建立好的PDX模型在患者体外可能会发生新的变异,同时由于肿瘤间质的丢失及微环境的改变往往会影响肿瘤的生物学表现;③建立的PDX模型有可能不能发生转移。

因此,骨与软组织肉瘤的PDX模型的建立成功率与患者的病理类型及是否化疗有关,并且建立的成功与否与患者的预后呈一定的关联。PDX模型与临床肿瘤之间保存了相似的特征。PDX模型可以为骨与软组织肉瘤患者的个体化药物筛选提供一定的信息。


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